이종 데이터 통합을 통한 복합형질 분석

Complex trait analysis with heterogeneous data integration

Jung Hoon Woo, B.S.1,3, Eun Jee Lee, B.S.1,  Ju Han Kim M.D., Ph.D.2,3*

1Interdisciplinary Program in Bioinformatics, Seoul National University, 2Seoul National University Biomedical Informatics (SNUBI), 3Human Genome Research Institute, Seoul National University College of Medicine, Seoul 110-799, Korea

*correspondence to juhan@snu.ac.kr

Abstract: A key object of biomedical research is to elucidate the complex gene interactions underlying complex traits such as common human disease. Recently 'genetical genomics approach' that use microarray expression data to measure the influence of genetic variation on gene expression has been established. Such an integration of the two heterogeneous genomic data have offered different perspective on complex trait analysis. In this research, we developed a multistep methodology with applying set-wise genetical genomics approach to uncovers polygenic interaction of complex trait. First we extracted CGS (complex-trait-related gene set) by correlation test from microarray data. Then we performed genome-wide DACE(differential allelic co-expression) test to find strongly associated genetic variant and gene set pair. Combining the results of two test by anchoring CGS, this approach can offer number of genetic markers associated with complex model.

Keyword: complex trait, genetical genomics, integration, heterogeneous data, polygenic interaction

Ⅰ. 배경

Complex trait analysis는 의료 생물학에서 가장 주된 연구 분야라 할 수 있다. 특히 유전자의 존재가 밝혀진 이래로 개체마다 서로 다른 genetic variation으로 설명 가능한 질병 model을 구체화하기 위해 유전학적 접근이 이루어져 왔다. 이는 간단히 genetic marker들과 trait사이의 linkage 혹은 association test를 통해 그 trait을 결정짓는 유전자의 위치를 추적하는 것이다. 그러나 단일 유전자의 변이가 trait을 결정짓는 monogenic case의 경우가 아닌 여러 유전자가 복합적으로 작용하여 나타나는 complex trait의 경우에는 이러한 기존의 방법론으로는 유의미한 marker locus를 찾기가 쉽지 않았다.

최근 ‘genetical genomics’ 라는 이름으로 DNA microarray data와 genome-wide SNP array data를 통합적으로 분석에 이용하는 방법론[1]이 나타남에 따라 complex trait을 modeling하기 위한 다른 각도의 접근이 가능해졌다. 소위 ‘genetical genomics approach' 란 각각의 mRNA expression을 기존 유전학에서의 quantitative trait으로 정의하고, linkage test나 association test를 수행하는 것이다. 즉, 특정 유전자의 expression 에서 genetic component로 설명할 수 있는 부분을 분리해 냄으로써 target 유전자에 대한 causal association을 상정할 수 있는 regulatory loci를 찾는 것이다 [2]-[5]. 유전자가 DNA에서 mRNA를 통해 expression한다는 central dogma를 기저에 두고 성립된 두 heterogeneous data 에 대한 통합은 각각을 이용할 때 보다 훨씬 생물학적으로 informative 하다. 이러한 방법론은 특히 complex trait analysis의 관점 에서 중요한 의미를 가진다. DNA marker loci와 trait 정보만을 이용하는 것이 아닌 중간 영역의 mRNA expression을 model에 포함시킴에 따라 보다 정확한 modeling이 가능해지기 때문이다.

한편으로는 DNA microarray data와 SNP array data를 동시에 분석에 사용하게 됨에 따라 대용량 data를 분석할 때 나타나는 limited sample, multiple testing problem, noise 등의 전형적인  문제를 그대로 상속받게 된다. 예컨대 유전자 각각을 독립적인 분석 단위로 취급하는 것이 expression 의 variance에서 보고자하는 효과를 추출해내는 것을 어렵게 만든다는 것은 microarray 분석 분야에서는 고전적인 문제점이다. GSEA(gene set enrichment analysis) 와 같은 group-wise approach는 기존의 생물학적 지식을 이용하여 grouping 한 유전자 set을 분석 unit으로 취급함으로써 위와 같은 문제점을 해결하고자 하였다[6].

유전자 set을 분석의 단위로 이용하는 것은 genetical genomics approach에서 또한 여러 가지 이유로 타당성을 확보할 수 있다. 기존의 방법론은 모든 mRNA expression을 독립적인 trait으로 취급하여 각각을 genetic marker와 test를 함으로써 유전자 수 * marker 수  만큼의 test가 이루어진다. 따라서 생물학적으로 관계있는 유전자 set을 하나의 trait으로 취급함으로서 test power를 확보 할 수 있게 된다[6]. 더욱이 대부분의 생물학적인 process는 개별 유전자의 독립적인 발현으로 이루어지는 것이 아니라 유전자 set의 co-expression으로 이루어진다는 점에서 유전자 set의 regulatory loci를 찾는다는 접근은 타당성을 보장받을 수 있다.

따라서 본 연구에서는 기존 genetical genomics의 통상적인 single gene-wise approach와는 다르게 유전자 set 과 genetic association 이 있는 marker들을 찾아낼 수 있는 DACE test를 개발하였고 이를 바탕으로 trait과 association이 있는 loci를 찾아냄으로써 기존의 genetic 접근과는 다른 방식의 complex trait analysis를 수행하였다.

Ⅱ 방법

1. The BXD RI data set.

본 연구에서는 BXD Recombination Inbred mice strain 에 대한 public data를 수집하였다. 먼저 각 BXD RI strain에 대하여 3,033 개의 SNP marker loci에 대한 genotype data를 webQTL (http://www.genenetwrk.org/)에서 downloading 하였다. 역시 BXD RI strain의 hematopoietic stem cell에 대한 DNA microarray gene expression data는 webQTL에서 download 하였다. 22개의 strain에 대하여 expression을 profiling 하였으며 각각 두개씩의 technical replicate 이 있다. BXD RI strain에 대해서는 public mouse strain phenome database   (http://www.nervenet.org/main/databases.html) 에서 hematopoietic stem cell 에 관련한 clinical trait, Proliferation of lin-Sca1++ cells responding to early-acting factors: kit ligand (KL), flt3 ligand (flt3L), thrombopoietin (TPO) 를 download 하였다.

2. Grouping genes.

유전자를 grouping 하는 방법은 chromosomal location, GO information등 여러 가지가 있을 수 있겠으나, 본 연구에서는 pathway information을 이용하였다. Biocarta pathway database (www.biocarta.com)의 정보를 이용하여 expression data에 사용된 Affymetrix U74Av2 GeneChip 의 12,488probe를 mapping 하였다. 그 중 1,435 개의 probe가 276 pathway member로서 확인되었다.

3. Correlation test.

기본적으로 1차원 trait vector와 gene expression matrix(row는 gene으로 column은 sample)를 가정할 때 matrix와 vector간의 correlation은 set에 속한 모든 유전자와 trait간 pair-wise correlation 값들의 평균으로 결정한다. 이와 같은 방법으로 모든 유전자 set마다 correlation statistic이 나오게 되며 이중 trait과 유의하게 관련 있는 set을 결정하기 위하여 permutation test를 수행한다. 즉, 주어진 trait vector의 resampling without replacement를 통해 새로운  trait vector를 구성한 후 앞서 언급한 방법을 통해 새로운 trait vector 와 gene expression matrix 간의 correlation statistic을 구한다. 이 과정을 10000번 반복하여 나온 correlation statistic permutation 분포를 구한다. 결국 주어진 set과 trait의 correlation statistic은 permutation 분포에서의 위치를 통해 p-value가 결정된다.

4. DACE (differential allelic co-expression) test.

우선 BXD RI　sample을 특정 SNP marker genotype에 따라 grouping 한다. 각 sample group 당 set에 속한 모든 유전자들의 all pair-wise correlation 값을 구한다. Sample의 genotype condition에 따라 correlation tendency가 변하는 가를 측정하기 위해 간단한 regression model을 가정한다. 이때 independent variable은 SNP genotype으로, response variable은 correlation 값으로 둔다. 이 때, correlation 값의 분포가 -1부터 1까지로서 normal distribution을 따르지 않기 때문에 Fisher's z transformation 이론을 적용한다. [eq. (1)]

각 sample group에서 생성된 z 값들은 독립이 아니기 때문에 아니기 때문에 기존의 linear model에서처럼 error term의 normality를 가정할 수 없다. 따라서 Generalized Estimating Equation[7] 이론을 사용하여 response variable간의 correlation을 model에 포함시키도록 한다. [eq. (2)]

이때, g(.)는 일반적인 generalized linear model에서의 link function을 나타내며, x는 marker genotype을 의미한다. GEE는 앞서 정의한 response variable인 z의 marginal expectation을 independent variable인 x의 함수로 나타낸다. 마지막으로 Wald's type test를 통하여 주어진 regression model의 coefficient가 0인지 아닌지 테스트 한다.

Ⅲ 결과

1. Finding CGS (complex-trait-related gene set).

Quantitative trait인 경우 그 complex trait과 association이 있는 gene set (본 논문에서 CGS 라 부르기로 한다)을 찾아내기 위하여 correlation test를 수행 한다. 본 연구에서 사용한 clinical trait은 Proliferation of lin-Sca1++ cells responding to early-acting factors로서 correlation test 결과, p-value 0.05의 significance level에서 22개의 pathway가 trait과 association을 보였다 (Table 1).

2. Genetic variation in gene set.

* Correlation test에서의 p-value

Table 1. Significant ftt3L/KL/TOP response CGS
Pathway	P - value*
Basic mechanism of action of PPARa, PPARb(d) and PPARg and effects on gene expression	0.0018
Proepithelin Conversion to Epithelin and Wound Repair Control	0.0038
Segmentation Clock	0.0050
IL 5 Signaling Pathway	0.0073
IFN alpha signaling pathway	0.0081
Acetylation and Deacetylation of RelA in The Nucleus	0.0092
Erythropoietin mediated neuroprotection through NF-kB	0.0101
BTG family proteins and cell cycle regulation	0.0152
Msp/Ron Receptor Signaling Pathway	0.0198
Complement Pathway	0.0201
Effects of calcineurin in Keratinocyte Differentiation	0.0208
Internal Ribosome entry pathway	0.0209
Free Radical Induced Apoptosis	0.0255
Nitric Oxide Signaling Pathway	0.0275
Degradation of the RAR and RXR by the proteasome	0.0302
Presenilin action in Notch and Wnt signaling	0.0318
Function of SLRP in Bone: An Integrated View	0.0392
Classical Complement Pathway	0.0418
IFN gamma signaling pathway	0.0420
Transcription Regulation by Methyltransferase of CARM1	0.0428
CD40L Signaling Pathway	0.0466
Regulation of hematopoiesis by cytokine	0.0499

유전자 set을 정의하고 그 set의 expression matrix에서 genetic variation을 찾기 위하여 본 연구에서는 DACE test(see Method)를 개발하였다. Expression matrix에서 SNP marker의 genotype information에 따라 sample이 grouping 한 후, 각 genotype group에서 유전자들의 correlation structure가 유의하게 변하는가를 test 함으로써 유전자 set과 marker 사이의association을 결정하였다.

본 연구에서는 pathway information으로 정의한 276개의 gene set과 3,033개의 genome-wide SNP marker들에 대하여 DACE test를 수행하였다. Multiple hypothesis testing에 대한 문제점은 Benjamini and Hochberg algorithm(8)을 적용하여 false discovery rate (FDR) 을 control을 하였다. FDR을 0.0001이하가 되도록 p-value threshold를 보정한 결과 12개의 pathway가 적어도 하나 이상의 SNP marker loci와 유의한 association을 보였다 (Fig 1).

12개의 pathway 중 앞서 언급한 proliferation of lin-Sca1++ cells responding to early-acting factors CGS에 속하는 pathway는 Regulation of hematopoiesis by cytokine, Msp/Ron Receptor Signaling Pathway가 있었다(Table 2).

Ⅳ. 결론

Fig 1. 두 CGS에 대한 DACE test의 whole genome-wide p-value distribution. 그래프의 X축은 각 SNP marker들의 chromosome 상의 위치를 나타내며, Y축은 각 marker와 pathway간의 test로 얻어진 p-value를 adjust 한 후 -log10()를 씌운 값이다. 붉은 선은 significance level을 나타낸다.

Complex trait은 여러 genetic factor의 combination으로 결정이 되는 것이므로, 정확히 몇 개의 유전자가, 그리고 어떤 유전자가 병에 영향을 미치는지 알 수 없는 상태에서 분석이 이루어진다. 따라서 marker 각각을 trait과 test를 할 수 밖에 없는데 complex trait의 경우에는 그를 결정짓는 요소가 많기 때문에 하나의 유전적 변이가 trait을 설명하는 부분이 작아져 linkage 혹은 association test시 적절한 test power를 확보하기가 힘들다. 더욱이 최근에는 whole-genome level에서의 SNP genotype information을 이용하게 되면서 발생하는 artifact, noise, multiple testing problem 등의 문제는 trait의 variation에서 marker의 genetic effect를 추출해내는 것을 더욱 어렵게 한다.

본 연구에서는 그러한 complex trait에 관여하는 유전적 변이를 찾아내기 위하여 두 종류의 heterogeneous data를 통합하여 분석하는 새로운 방법론을 제안했다. 즉 correlation test를 통해 complex trait과 유의미한 association을 보이는 유전자 set을 추출한 후 그 set과 genetic association을 보이는 marker를 DACE test로 찾아냄으로써 기초적인 수준에서의 complex trait model을 세운 것이다. Complex trait의 경우 그를 발현하는데 관여하는 여러 유전자 set들이 결정되고, 그 set들의 발현에 대한 regulatory loci가 결정이 된다면 DNA locus - gene set - trait 으로 표현 가능한 association model이 구성된다. 이러한 방법론은 다른 complex trait, 예컨대 당뇨와 비만과 같은 complex disease 연구에도 적용될 수 있다. 다시 말하여 하나의 개체에 대하여 DNA microarray data와 SNP array data, 그리고 disease여부에 대한 data 가 있다면 disease를 결정짓는 유전적 요인을 새로운 방식으로 찾아볼 수 있는 것이다.

* Linkage disequilibrium (LD) 상태에 있는 marker들은 genotype이 대부분 같으므로 test 결과가 거의 동일함.

✝ LD region marker들의 DACE test p-value 중 가장 높은 것을 취함.

Table 2. Significant SNP marker for CGS
Pathway	SNP marker*		Chromosome	cM	P-value✝
Regulation of hematopoiesis by cytokine		rs6241342 - rs6271956	7	80.6-80.6	7.20e-09
		rs6209128 - rs3023086	13	34.7-34.7	1.34e-08
Msp/Ron Receptor Signaling Pathway		rs13479023 - rs3664540	6	93.6-102.2	7.898e-12
		rs6183014 - rs13480109	9	5.1-5.4	1.40e-11
		rs6402097 - rs6185805	17	37.9-39.7	2.76e-07

DNA level에서 complex trait에 이르기까지 그 중간영역에는 mRNA, protein, 그리고 metabolite 등, 수많은 생체 분자의 복합적인 작용이 깔려 있다. Genomics technology의 발전으로 생체 분자들의 발현을 전체 genome 레벨에서 측정할 수 있게 되었고, 이 엄청난 양의 정보들은 complex trait에 대한 연구에 거대한 시너지 효과를 불러일으킬 수 있게 되었다. 본 연구와 같이 각기 다른 생물학적 레벨에서 측정한 data를 통합적으로 분석하는 것은 매우 많은 시간과 노력이 필요하지만 기존의 방법론으로서 해결하지 못했던 많은 부분에 새로운 관점의 분석을 가능케 할 것이다.

감사의 글

본 논문의 작성에 많은 도움을 주신 서울의대 생명의료정보학 연구실 분들께 감사드립니다. This study was supported by a grant from Korea Health 21 R&D Project, Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (0412-MI01-0416- 0002).

참고문헌

1. Jansen, R. C., and J. P. Nap Genetical genomics: the added value from segregation. Trends Genet, 17: 388–391 (2001)

2. Schadt EE, Monks SA, Drake TA, Lusis AJ, Che N, Colinayo V, Ruff TG, Milligan SB, Lamb JR, Cavet G, et al. Genetics of gene expression surveyed in maize, mouse and man. Nature, 422:297-302 (2003).

3. Cheung, V. G. and R. S. Spielman The genetics of variation in gene expression. Nat. Genet. 32(Suppl.):522-525 (2002).

4. Schadt EE, Monks SA, Drake TA, Lusis AJ, Che N, Colinayo V, Ruff TG, Milligan SB, Lamb JR, Cavet G, et al. Genetics of gene expression surveyed in maize, mouse and man. Nature, 422:297-302 (2003).

5. Morley M, Molony CM, Weber TM, Devlin JL, Ewens KG, Spielman RS, Cheung VG. Genetic analysis of genome-wide variation in human gene expression. Nature, 430(7001):733-4 (2004).

6. Mootha, V. K., Lindgren, C. M., Eriksson, K. F., Subramanian, A., Sihag, S., Lehar, J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., et al. PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes. Nat Genet. 34: 267-273 (2003).

7. Scott L. Zeger, Kung-Yee Liang; Paul S.Albert Models for longitudinal data: A generalized Estimating Equation approach. Biomerics, 44:1049-1060  (1998).

8. Y. Benjamini and Y. Hochberg. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Statist. Soc. B. Vol. 57: 289-300  (1995).